Buongiorno a tutti e grazie per esservi registrati al webinar organizzato da Promega Italia in collaborazione con l'Istituto di ematologia Seragnoli di Bologna. Io sono Luca Pozzana, technical Instrumentation Specialist di Promega Italia e nella prima parte del Webinar vi parlerò della soluzione ideata da Promega per l'estrazione automatizzata di acidi nucleici. Nella seconda parte del webinar, invece, la dottoressa Marina Martello e la dottoressa Barbara Taurisano del Seragnoli di Bologna, che sono in collegamento già adesso, Ciao Marina. Ciao Luca e Ciao a tutti. E Ciao Barbara. Ciao a tutti, grazie Luca. E allora? Loro ci racconteranno della loro esperienza sull'utilizzo del DNA libro circolante per lo studio della patologia mieloma multiplo, facendoci vedere sia il loro workflow estrattivo da biopsia liquida, ma anche un esempio di studio applicativo. Vi ricordo che potete usare la chat sia per inviare le vostre domande, a cui cercheremo di rispondere durante il webinar, ma anche per richiedere il certificato di di partecipazione. Inoltre vi ricordo prima di iniziare che alla fine del webinar riceverete un'email con il link per accedere alla registrazione. Possiamo quindi partire con la prima parte del webinar in cui vi parlerò del sistema Maxwell che è l'estrattore automatico magnetico di acidi nucleici, prodotto e ideato da Promega Corporation con la prima slide. Vorrei approfondire con voi un po' la storia del Maxwell, questo strumento innovativo che è basato su una tecnologia che sfrutta le proprietà delle particelle paramagnetiche. La nostra avventura con il Maxwell inizia nel 2005 con il lancio del primo modello, il Maxwell 16 instrument, uno strumento in grado di processare da uno a 16 campioni. Questa caratteristica sarà una caratteristica costante dei dei successivi modelli per oltre 10 anni, come per lo stesso modello Max. 16 instrument lanciato nel 2007 ma con un nuovo design e alcune nuove funzionalità. Nel 2009 il turno dello strumento Max 16 MDX instrument. Con questo modello sono stati introdotte numerose nuove funzionalità che hanno migliorato la sicurezza, la praticità d'uso e la capacità di tracciabilità dello strumento. L'anno successivo, nel 2010, abbiamo ottenuto la marcatura CVD di questo strumento. Diciamo che questo traguardo ha confermato l'elevato standard qualitativo del nostro strumento, permettendone però anche l'utilizzo per applicazioni diagnostiche indietro, ma è con il 2015 che abbiamo avuto la svolta più importante, quella che ha portato a più innovazioni dal 2015 in poi. E sono stati lanciati i modelli i nuovi modelli Maxwell e attualmente sono disponibili quattro che differiscono essenzialmente per la loro capacità di processamento di campioni, ovvero da uno a 16 campioni e da uno a 48 campioni, e per la loro destinazione d'uso. Abbiamo quindi a disposizione lo strumento ad uso di ricerca da uno a 16 campioni Maxwell ERSC, quello da uno a 48 campioni Maxwell RSC 48 e quelli ad uso medico diagnostico in d. Quello da 16 campioni Maxwell, CSC e quello da 48 campioni Maxwell, CSC 48. Vediamo ora come si basa il processo estrattivo del Maxwell. Innanzitutto bisogna dire che il Maxwell utilizza dei kit dedicati, i kit Maxwell, che consentono l'estrazione di 48 campioni e contengono eventuali reagenti di pre trattamento. Ubi e buffer di edizione, l'Accessorio Planger di cui adesso vediamo un'immagine che essenzialmente è l'unico accessorio necessario alla pulificazione, ma di fondale di fondamentale importanza visto le sue funzionalità che vedremo a breve e ovviamente le 48 cartucce monouso che sono già confezionate prealiquotate con tutti i reagenti necessari alla pubblicazione. In generale i sistemi Maxwell sono direi semplici da utilizzare, infatti è sufficiente preparare i vassoi o il vassoio estrattivo con le cartucce preparate, inserirli all'interno dello strumento come vedete nell'immagine e andare a selezionare il programma desiderato. Dopodiché ci pensa il match. I principali passaggi estrattivi che avvengono sulla cartuccia estrattiva sono comuni a tutti i programmi degli estratti di Maxwell e sono caratterizzati tutti dall'uso costante del dell'ACCESSORIO planger, che in primis garantisce l'assenza di qualsiasi tipo di contatto della strumentazione con i campioni e con i reagenti. La prima fase. È contraddistinta da una miscelazione elisi del campione, che avviene tramite movimentazione su e giù del planger nello scompartimento numero 1. Successivamente lo strumento andrà a attrarre magneticamente le particelle paramagnetiche dallo scompartimento numero 2 per rilasciarle all'interno dello scompartimento numero 11. Contatto con il disagio cellulare. Ed è qua che avviene il legame dell'acido nucleico. Alla particella paramagnetica questo processo di attrazione magnetica delle particelle e loro rilascio negli scompartimenti successivi è consentito grazie alla presenza all'interno dello strumento. E un blocco magnetico che è costituito da una serie di astine metalliche alla cui estremità inferiore è presente un potente magnete. Bene, ogni singola spina metallica entra in grado di entrare nella cavità del planger, permettendo quindi alle particelle paramagnetiche di attaccarsi alla punta chiusa del Planger stesso. A questo punto le particelle potranno essere movimentate negli scompartimenti successivi e essere rilasciate nello scompartimento successivo tramite effetto contrario, ovvero tramite fuoriuscita della astina metà quindi del magnete dalla cavità del planger eravamo rimasti al legame dell'acido nucleico e la particella paramagnetica bene. Una volta avvenuto questo legame, le particelle paramagnetiche saranno movimentate, sempre magneticamente tramite il planger negli scompartimenti successivi di lavaggio, fino ad arrivare al tubo di edizione finale, dove è sufficiente una soluzione acquosa per permettere il distaccamento delle particelle paramagnetiche dagli acidi nucleici di interesse. Tutto il processo estrattivo può variare dai 20. 70 minuti circa e questo dipende dal kit estrattivo utilizzato. Vediamo ora velocemente quali sono le caratteristiche principali degli strumenti Maxwell. Gli strumenti Maxwell sono adattabili a qualsiasi ambiente di laboratorio, infatti sono degli strumenti da banco con delle ridotte dimensioni e un bassissimo peso. A titolo esemplificativo, nell'immagine potete vedere il modello da 48, che è il modello più grosso con me a fianco. Gli strumenti Maxwell sono anche altamente pratici, in primo luogo perché viene fornito un tablet PC con la strumentazione su cui è già preinstallato il software Maxwell che gestisce la strumentazione stessa. Bene, questo software, voi potete vedere un'immagine a lato, consente una facile impostazione dei settaggi generali e della seduta estrattiva, inoltre permette la creazione automatica di una lista di estrazione. Infine. Dal momento in cui abbiamo visto che i reagenti necessari sono già reali quotati nella cartuccia estrattiva e dal momento in cui lo strumento non entra mai in contatto diretto con i liquidi, che siano campioni o che sia reagenti, la manutenzione ordinaria con i sistemi Maxwell è veramente veramente migliore. Con gli strumenti Maxwell inoltre è garantita la tracciabilità. Vengono forniti, viene fornito un lettore di codice a barre che è collegabile allo strumento e lo si può utilizzare sia per la selezione del metodo escattivo, andando a scansionare il codice a barre presente sulla confezione del kit da utilizzare, ma anche per l'acquisizione di quelle informazioni presenti nei codici a barre ma relative a campioni ed agenti. Alternativamente al al lettore di codice a barre è possibile utilizzare la tastierina virtuale del software del tablet. Inoltre, a fine seduta estrattiva il Maxwell fornisce il report di estrazione. Questi report sono costituiti dai dati raccolti prima e durante l'estrazione. Potete vedere un'immagine all'atto di un report di estrazione. Ebbene, questi report di estrazione possono essere stampati ed esportati in un percorso di archiviazione del tablet PC stesso, oppure anche in un. Dispositivo USB per il trasferimento in un computer separato con gli strumenti Maxwell è garantita anche la sicurezza, in primo luogo perché la Camera di lavoro, ovviamente all'interno dello strumento è protetta da uno specifico sportello, in secondo luogo, all'interno della Camera di estrazione non avviene mai e mai alcun spostamento di liquidi. Possono, ripeto, possono essere campioni, ma anche reagenti in grado di provocare cross contaminazione. Infatti, come abbiamo visto prima, sono esclusivamente le particelle paramagnetiche ad essere movimentate, magneticamente e non, tramite aspirazione e rilascio. Inoltre è presente all'interno dello strumento una lampada UV che è già preinstallata e questa può essere utilizzata per ridurre la contaminazione della camera di lavoro. Infine per i modelli da 48 campioni. È presente il Vision System che è un sistema sviluppato da promega che è un sistema a telecamera che serve per verificare la correttezza di inserimento di tutti i consumabili, ovvero le cartucce. La Angers i tubi di eluizione poco prima dell'avviamento della seduta esternatura. In caso un operatore compie un errore, lo strumento si accorgerà. Lancerà un allarme, non farà avviare la seduta estrattiva e permetterà all'operatore di correggere l'errore. Con gli strumenti Maxwell e con i kit dedicati è anche garantita la versatilità, in primis è possibile estrarre anche il singolo campione senza la necessità di dover processare campioni inutili. Contemporaneamente questa questa caratteristica è molto importante per quei laboratori che devono processare anche il singolo campione di di urgenza. Arriviamo adesso a una delle caratteristiche principali della tecnologia del Maxwell, ovvero che nella stessa seduta estrattiva è possibile variare il quantitativo di partenza e il volume di edizione di ogni singolo campione. Questa caratteristica, che possiamo dire è una caratteristica di ottimizzazione delle cose, può essere amplificata andando a utilizzare dei kit Maxwell che con un unico protocollo automatizzato permettono l'estrazione degli acidi nucleici da diversi materiali di partenza, quindi in questo caso avremmo che nella stessa seduta estrattiva è possibile variare il tipo di materiale di partenza, il suo quantitativo, il volume di edizione. Di ogni singolo campione. Versatilità vuol dire anche ampio portfolio di kit estrattivi, ne abbiamo ben 34 kit a catalogo che permettono l'estrazione degli acidi nucleici dati differenti materiali di biologici. Quindi in sintesi, gli strumenti Maxwell, come dire, sono stati progettati in primis per essere adattabili a qualsiasi ambiente di laboratorio. A essere pratici, ad essere sicuri e a essere anche soprattutto. Particolarmente versatili e tutto questo ha permesso al Maxwell, nel tempo ovviamente, di essere presente in differente realtà, ma di ambiti differenti, a partire, per esempio, dall'ambito umano, ma anche per l'ambito agroalimentare, l'ambito veterinario, l'ambito ambientale, fino a arrivare all'ambito forense. Ora facciamo una. Veloce panoramica dei kit Maxwell e della maggior parte dei kit Maxwell che sono a disposizione, a partire da quelli che consentono l'estrazione del DNA genomico. Come potete vedere i sistemi sono diversi, ne abbiamo due per l'estrazione da sangue intero periferico, uno per preparazione batti coat, uno per tamponi vocali e uno per saliva stabilizzata. Ne abbiamo anche uno per tessuti. Possono essere ovviamente freschi o congelati e anche uno per colture cellulari, fino ad arrivare a uno degli ultimi kit lanciati da promega che è il Maxwell genomic dname kit che è un kit direi universale in quanto è in grado di andare a estrarre il DNA genomico da tutti i materiali di partenza di equipe che ho appena citato e da sangue midollare da urine. Ma anche da altri fluidi biologici, come per esempio il liquido amniotico. Oltre a tutti i kit che abbiamo a disposizione per l'ambito agroalimentare, ambientale e forense, che oggi non menziono, abbiamo anche due sistemi per l'estrazione del DNA genomico, da tessuti inclusi in paraffina e fissati in formalina. Ma anche infine abbiamo il il sistema per estrarre. Il DNA batterico dalle feci per l'analisi e lo studio del microbioma intestinale. Abbiamo poi altre tipologie di kit estrattivi, a partire da quelli che consentono l'estrazione degli acidi nucleici totali. Abbiamo due sistemi. Il primo è il sistema Viral che, come dice il nome, è in grado di estrarre gli acidi nucleici totali virali da plasma, da da siero ma anche da tamponi nasofaringe in in media UTMUPM. Abbiamo anche infine l'ultimo kit lanciato da promega, il patto Gem kit, che è veramente un sistema particolarmente universale perché è in grado di estrarre gli acidi nucleici totali. Virali matterici parassitari da una molteplicità di campioni diversi come le feci, urine, lavaggio broncoalveolare sempre i tamponi nasofaringei, gli espettorati il plasma fino ad arrivare ai tamponi cervicali. Ovviamente abbiamo anche i sistemi per estrarre le R naturale, a partire da quello da SANCO intero periferico, ma abbiamo ne abbiamo anche uno per le colture cellulari e due per l'estrazione da tessutiche. Che ricordo possono essere freschi o congelati. Primo il permette l'estrazione della ragna, il secondo, il Mir Natishu, permette l'estrazione della ragna totale comprensivo di e infine abbiamo ovviamente anche il sistema per estrarre. Con queste invece ultime due slide vorrei far vedere. Cosa promega offre per quanto riguarda l'estrazione degli acidi nucleici circolanti a partire dal sistema per l'R NA, il kit match mirna plasma in serum è un sistema che consente di più rispetto a quello che dice il nome. Infatti è un sistema in grado di estrarre l'r NA totale comprensivo di micror NA da plasma siero da Udine ma anche da. Le vescicole extracellulari, o meglio dagli esosomi in quanto gli esosomi, sono quelle vescicole extracellulari che contengono, oltre ADNA, proteine di membrana, liquidi di membrana che contengono più forme di RNA rispetto alle altre vescicole extracellulari, ovviamente micro RNA compresi, a completamento del workflow estrattivo dalle vescicole extracellulari. Pro mega non da tanto commercializza la tecnologia exsmet, che è una tecnologia che serve proprio per isolare le vescicole extracellulari da diversi intuiti biologici. Questa tecnologia è basata su immunoaffinità di biz magnetiche che con una matrice anticorpale vanno a riconoscere le proteine di membrana tipiche. Di delle delle Vescicole Extracellulari. Con questa invece ultima slide vorrei farvi vedere quello che invece promega offre per l'estrazione del DNA librocircolante. Ricordiamo l'importanza del DNA Librocircolante che è presente nel nostro flusso sanguigno e che offre una preziosa. Come dire, opportunità per analizzare lo stato di salute di un individuo senza ricorrere a dei metodi invasivi. Il DNA libro circolante proviene dalla cromatina che viene rilasciata su base continua nel nostro flusso sanguigno dalle cellule in fase moriente. Questo DNA, che si trova quindi non protetto, viene rapidissimamente degradato. Principalmente, ma non esclusivamente, in frammenti di circa 170 paia basi OO poco +1. Aspetto importante del DNA Libro circolante è sicuramente il suo rapido turnover, infatti hanno una emivita bassa di circa 30 minuti circa. Questo vuol dire che i livelli di DNA libro circolante possono variare in modo tempestivo e anche in modo significativo, quindi andando a riflettere. Quelli che sono i cambiamenti fisiologici e patologici che avvengono nel nostro corpo umano. Tipicamente i livelli di circolante sono in condizioni standard particolarmente bassi, infatti si parla all'incirca di un minimo di 5 a un massimo all'incirca di 20 nanogrammi di PNA libero circolante per ML di plasma. Ma questi livelli, come abbiamo già detto, possono variare, più che altro possono purtroppo. Aumentare per diversi fattori, anche semplicemente per un aumento della frequenza cardiaca dovuta a attività sportiva, ma anche a traumi, infezioni OA purtroppo alla presenza di di di tumori. Promega commercializza due sistemi per l'estrazione del DNA libro circolante. E ovviamente garantiscono un DNA libro circolante di elevata resa e con una purezza e qualità tale da poterlo usare nelle applicazioni a valle più comuni come digital, CRNCS, Real Time, CRE. Altre applicazioni abbiamo due sistemi. Il primo è un sistema completamente automatizzato e che ti permette di estrarre DNA libro circolante da un ML di plasma. Il secondo sistema invece è un formato, come dire largevole, che presuppone una parte manuale, ma ti permette comunque di estrarre il DNA libro circolante fino a 8 ML di plasma. Entrambi i kit, che hanno una procedura totale di estrazione poco superiore all'ora, quindi direi anche particolarmente rapidi, sono stati testati con successo anche su nicor, siero EE urine. E niente, con questo è tutto per la prima parte del webinar. Io vi ringrazio e lascio spazio ora alla dottoressa Marina Martello e Barbara Taurisano del Serranno del di Bologna per la seconda parte grazie. Ciao a tutti, grazie Luca per avermi passato la parola e grazie anche a promega per averci dato. L'opportunità di presentare la nostra esperienza che abbiamo condotto finora qua all'Istituto di ematologia Seragnoli di Bologna nell'ambito dello dell'utilizzo del diario libero circolante per studiare una malattia in particolare, che è il mio lama multiplo. Diciamo che come sammari di questa presentazione farò io una breve introduzione sulla patologia, perché magari non tutti l'hanno la conoscono il mio lama multiplo. Parleremo poi qualche cenno di di Opsa liquida e in particolare, appunto del progetto AIRC che abbiamo cominciato ormai circa 5 anni fa e che prevederà appunto lo studio del biennio libero circolante. Poi prenderà la parola alla mia collega, la dottoressa Barbara taurisano, che vi parlerà nel cuore della presentazione. Quindi come abbiamo affrontato il problema della dell'isolamento, del processamento, del biennale libero circolante e infine riprenderò la parola io per darvi, diciamo 1 1. Una carrellata di slide per avere un, diciamo 1 1 prospettiva di possibile utilizzo del Diana Libro circolante e della sua informatività e utilizzo nell'ambito del mio lama multiplo. Allora brevi cenni sulla patologia. Perché è importante l'implementazione della viux liquida in questo tipo di patologia? Innanzitutto è una patologia mio lama multiplo che ha luogo nelle plasmacellule a livello del midollo osseo. Questo vuol dire che per il suo studio, dal punto di vista molecolare, diagnostico e prognostico è necessario fare quindi un prelievo di midollo osseo che come possiamo immaginare è un prelievo invasivo. È una malattia inoltre caratterizzata da una notevole eterogeneità genomica e genetica, quindi che fa sì che ogni paziente, nonostante ricevano tutti un'unica diagnosi di miloma multiplo, in realtà presentino delle caratteristiche molecolari biologiche particolarmente specifiche. Motivo ulteriore per cui è utile studiarne la biologia e in terzo luogo diciamo che è ancora più complicato dal punto di vista biologico, perché può cambiare sia nel tempo che nello spazio. Quest'ultimo particolare molto interessante perché, essendo una patologia che può essere studiata anche con metodiche e costose invasive come le metodiche di imaging, per esempio la. Le PET CTO, le risonanze magnetiche questo perché è una patologia che oltre al midollo osseo come sede, può avere sedi extramidollari e quindi la possibilità di di studiare un marcatore nel sangue periferico come il viene libero circolante in questo momento lo sta rendendo particolarmente attraente. Quindi e come si può studiare? Come possiamo affrontare lo studio della malattia del mio lama multiplo mediante i marcatori periferici? Possiamo studiare almeno 5 tipi di marcatori. Possiamo studiare nel libro circolante le plasmacellule circolanti, le extra vescicole, le proteine e anche l'arena esosomiale. Noi nell'ambito di questo progetto abbiamo scelto il Vienna libero circolante e anche le cellule presmacellule circolanti. Oggi l'oggetto della presentazione sarà soprattutto su Vienna libero circolante e perché, appunto, risulta particolarmente informativo? Prima di tutto si tratta di piccoli frammenti di DNA dell'ordine delle 170 190 paia di vasi. Generalmente, anche se diversi studi hanno dimostrato. Che possiamo trovare frammenti anche di peso superiore a questi tipo delle dell'ordine delle 10.000 paia di basi in base al meccanismo mediante il quale viene rilasciato e viene libero circolante. Quindi se abbiamo un rilascio tramite apoptosi, generalmente sono frammenti nell'ordine delle 180 paia di basi. Meccanismi per esempio come necrosi possono rilasciare frammenti maggiori. Sono stati descritti inoltre anche meccanismi di rilascio at. Vivo e rilascio di Tramediante secrezione è associata a fenomeni infiammatori. Ma come accennava anche prima, Luca può essere rilasciata anche da cellule normali e questo diciamo confonde un po' quando noi lo vogliamo studiare, appunto lo vogliamo utilizzare per lo studio del tumore EE vediamo appunto come l'abbiamo impiegato nel nostro progetto. Noi abbiamo scritto circa 5 anni fa questo progetto chiamato streaming. Proprio perché siamo andati nel bloodstream, nel flusso sanguigno, a cercare questi marcatori di Vienna libero circolante e le plasmacellule circolanti. Ovviamente quando si fa questo tipo di studi, non essendoci ancora un Gold standard, si utilizza come riferimento il tessuto appunto definito Gold standard che nel. Mieloma e il midollo osseo. Quindi tutte le volte che noi facciamo uno studio su un marcatore circolante nell'ambito del mieloma dobbiamo sempre avere come confronto. Quello che è, diciamo il riferimento nella patologia. Quindi Detto questo noi abbiamo fatto poi un biobanking, come vedete mostrato in questa immagine in cui il midollo veniva raccolto ogni sei mesi, quindi i pazienti venivano profilati alla diagnosi della malattia, il midollo veniva raccolto ogni sei mesi, ogni mese veniva raccolto il il sangue periferico per l'isolamento del pieno libero circolante e ogni tre mesi la caratterizzazione invece delle plasmacellule circolanti. Abbiamo fatto, abbiamo avuto alcune evidenze già di questo tipo di studi che vedremo appunto nella parte successiva della presentazione. Ora passo la parola, appunto alla mia collega Barbara taurisano che vi parlerà invece di come abbiamo affrontato il problema dell'isolamento del biennale libero circolante. Buon pomeriggio a tutti, mi mi unisco a Marina. I ringraziamenti ai saluti di Marina fatti inizialmente e. Continuando appunto la nostra presentazione sulla sul DNA libero circolante, però facciamo un passo indietro, cioè prima di capire come è possibile isolare il Selfly DNA da un prelievo di sangue periferico, cerchiamo di capire come è possibile collezionare, appunto nel modo più specifico e migliore possibile, il sangue periferico. A seconda degli scopi, degli obiettivi e delle esigenze del laboratorio, possiamo scegliere diversi tipi di provette. In commercio ce ne sono diverse. Ciascuna provetta permette di stabilizzare per un tempo più o meno lungo il DNA libero circolante. Per esempio, partiamo dalle provette classiche provette a tappo viola, quindi le provette in IDTA che ci garantiscono una stabilizzazione del self di DNA fino a quattro ore dopo il prelievo per poi passare a delle provette. Come gli strech e le e come le provette strech e le pax Gen che invece ci consentono da linee guida di stabilizzare i segnali vero circolante da tre a 14 giorni dopo il prelievo. Nel nostro caso preferiamo per la pratica quotidiana utilizzare le provette in IDTA perché il nostro workflow ci garantisce di di isolare il plasma dal quale verrà poi estratto il segnale libero circolante entro le quattro ore dal prelievo. Per progetti invece che prevedono il trasporto del prelievo da un da un centro all'altro preferiamo utilizzare gli stretcube. Abbiamo avuto anche modo di testare le provette pax Gen e anche se la nostra esperienza è piuttosto limitata, infatti in questo caso vi ho portato due casi, abbiamo appunto pensato di testarle di correlare le performance delle Pax Gen con le provette in EDTA, che sono quelle che utilizziamo principalmente. Abbiamo testato due. Due differenti time point, il tempo zero e il t 48, cioè tempo zero, significa che il abbiamo deciso di isolare il plasma, da cui poi abbiamo estratto il segnale libero circolante subito dopo il prelievo. Nel caso delle provette e nel caso appunto del time point a 48 appunto, abbiamo isolato il plasma dopo 48 ore dal dal prelievo. Una volta isolato il il plasma abbiamo estratto il denali libero circolante, lo abbiamo quantificato con metodica qubit. In questa tabellina vi ho riportato le concentrazioni che abbiamo ottenuto. Come possiamo osservare le concentrazioni tornano appunto sono sono simili tra le due? Tra le due. Provette nei differenti time point osserviamo un incremento della quantità di DNA libero circolante a 48 ore sia per le provette in DPA che per le pax gene e essenzialmente quello che però possiamo osservare è comunque una maggiore migliore stabilizzazione del DNA libero circolante da parte delle pax gene, sia al tempo zero che al T 48 in questo caso. Ok, in questo caso vi ho riportato il nostro flusso di lavoro che abbiamo appunto messo, abbiamo cercato appunto di di stabilizzare nel corso del tempo. Allora il nostro workflow prevede di prevede che partiamo da due provette da 10 ML di sangue periferico, le quali vengono centrifugate a 2500 RPM per 20 minuti in modo da poter da poter separare tutte le varie componenti, quindi il plasma. Dalla dall'interfaccia del bappi cotte e dai globuli Rossi che invece si depositano sul fondo della provetta. In questo caso preleviamo il plasma in maniera delicata e molto lentamente per non andare ad intaccare l'interfaccia di bappi cotte e storiamo il plasma in questi criotubi da 1,8 ML. Generalmente da 20 ML di sangue periferico otteniamo più di 7 ML di plasma. Il plasma viene ristorato a -20 ° fino alla successiva al successivo utilizzo, quindi all'estrazione che ormai abbiamo implementato e migliorato con la strumentazione in promega e una volta che abbiamo estratto il DNA libero circolante, lo quantifichiamo tramite qbit e. Laddove notiamo una quantità nanogrammo microlitro alta rispetto alla nostra, alla nostra esperienza facciamo anche un check, un check della qualità del sell free DNA estratto utilizzando la tape station. Quindi ormai estraiamo DNA libero circolante dal 2018 siamo passati da un protocollo manuale che sicuramente era più dispendioso da un punto di vista di tempo, a un protocollo semiautomatizzato, chiamato così perché nel nel primo step è prevista un è previsto un pre processamento manuale del campione. Anche in questo caso abbiamo cercato di validare il protocollo in base alle nostre esigenze e ci siamo settati su una quantità iniziale di 3,6 ML di plasma. Quindi seguendo il protocollo alla fine siamo riusciamo ad estrarre una quantità di DNA libero circolante ottimale. Per gli studi successivi la quantità del del DNA libero circolante viene valutata col qvit. E poi come ho anticipato prima, laddove vediamo notiamo una elevata quantità, facciamo anche decidiamo anche di fare un check alla Tip Station per valutare proprio se la. Quantità l'elevata quantità che osserviamo dall'estrazione è tutta attribuibile al self di DNA, oppure ci potrebbe essere in quei in altri casi, in alcuni casi contaminazione dal DNA genomico o da DNA che viene rilasciato da altre cellule. In questo caso vi ho riportato un po' di di esempi per distinguere 1 1 buon profilo di selfie DNA da un profilo diciamo meno buono contaminato. Questo è un buon profilo di DNA libero circolante perché osserviamo un picco sulle 192 paia di basi. Infatti sappiamo che i frammenti di DNA si aggirano tra le 150 e le 200 paia di basi. Anche in questo caso abbiamo un buon profilo di DNA libero circolante, sebbene osserviamo due picchi. Il secondo picco però possiamo notare che risulta essere un multiplo del primo picco, quindi riporta bene la il caso in cui il DNA libero circolante fa il i suoi avvolgimenti intorno al Nucleosma. In questo caso abbiamo due picchi, ma il profilo non è ottimale come quello che abbiamo visto prima perché il secondo picco è a elevate elevato peso molecolare. Questo potrebbe indicare una contaminazione da DNA genomico oppure una contaminazione da DNA rilasciato da cellule normali che nel corso appunto del tempo sono andati incontro a fenomeni per esempio di necrosi. Quindi in questo caso il profilo che vi ho riportato lo abbiamo ottenuto tramite. Limite tape Station con il kit di 1000 ma per escludere che questa sia una contaminazione da DNA genomico, possiamo fare una corsa del DNA con il kit appunto genomico. Dal 2018 abbiamo estratto più di 1200 DNA Libericircolanti estratti da campioni di pazienti con meloma multiplo, con leucemia plasmacellulare e con plasmocitomi, nonché da eltydons. Nella tabellina sottostante vi ho riportato le quantità mediane, quindi anche i minimi e i massimi, nonché la quantità totale in nanogrammi di DNA che abbiamo estratto a partire appunto da 3,6 ML di plasma. La quantità. Più bassa la concentrazione più bassa che abbiamo ottenuto è 0,3 e è stata questa è stata estratta da plasmi che derivavano da eltidonor e invece la quantità più alta di 1,14 derivava praticamente da plasmi che invece erano stati isolati da sangui periferici di pazienti con leucemia plasmacellulare. Infatti, da letteratura è noto che la leucemia plasma cellulare, quella fase della malattia caratterizzata dalle Escape della malattia che dal midollo va nel sangue periferico, in totale a partire da 3,6 ML di plasma siamo riusciti ad isolare fino a 68 nanogrammi di di DNA libero circolante. Che cosa utilizziamo il self pri DNA nella nostra routine? Il self pri DNA è il protagonista di esperimenti di Ultralo Pass Vulginum sequencing nell'ambito del progetto streaming che ci ha anticipato Marina e utilizziamo praticamente un il protocollo di Ultralow pass perché questo tipo di protocollo ci permette di partire da basse quantità di DNA libero circolante e quindi da un input compreso tra uno e 30 nanogrammi in un volume massimo di 10. Microlitri il selfie DNA, come abbiamo potuto notare dalle anche dalle dai profili alla Tim Station, è un è un DNA già frammentato, quindi in questo caso non è necessaria per la preparazione delle librerie non è necessaria la frammentazione, quindi lo step di frammentazione che invece è tipico dei protocolli di preparazione delle librerie con DNA genomico. Quindi una volta che abbiamo appiccicato i nostri adatta. Editori alsel free DNA facciamo un'amplificazione e una purificazione, una purifica delle nostre librerie, quindi quantifichiamo e poi andiamo in sequencing nella diciamo nella nostra routine utilizziamo come sequenziatore il next SEC 5 e 50 di illumina e utilizziamo appunto le i. Facciamo esperimenti di ultra lo pass per valutare il profilo copy number di questi pazienti e quindi? Profilo Copenaghen del a livello del self di di pazienti con meoma multiplo. Ma a questo punto lascio la parola a Marina che vi spiegherà bene quali sono i risultati che abbiamo ottenuto in questo studio. Allora grazie Barbara e appunto gli ultimi, gli ultimi minuti per darvi un esempio pratico applicativo di cosa abbiamo combinato con tutti questi scenari pero circolanti. Allora il progetto appunto, come vi accennavo inizialmente, prevedeva quindi l'implementazione di questi marcatori periferici a quelle che sono le metodiche Gold standard di studio della malattia, quindi midollo osseo e metodiche di imaging, i pazienti sono stati quindi profilati alla diagnosi mediante selfie, DNA, midollo osseo EE imaging e anche durante, diciamo nelle fasi post terapia. Quindi quando il clone? A livello midollare si riduce molto e si va, diciamo, a vedere cosa rimane di questo di questa malattia in periferia. Come vi accennava Barbara, è la metodica che noi abbiamo deciso di utilizzare. L ultra, lo password all genus sequencing, che è molto informativo perché è associato all'algoritmo che abbiamo utilizzato per l'analisideidaticheel'algoritmoecoa.cn a permette quindi di chiamare le copy number. Le Copenaghen e il mieloma sono, diciamo un marcatore distinguo della malattia, perché permettono di individuare a livello cromosomico tutte le amplificazioni delle azioni che sono ristrette, diciamo a quella che è la malattia, quindi non si trovano su un campione sano. Questo vuol dire che mediante l'utilizzo di quest'algoritmo andiamo da una parte qualitativamente a individuare le copy number e dall'altra abbiamo, se appunto è presente malattia, una valutazione quantitativa della frazione tumorale. Quindi qual è stato uno dei primissimi risultati? Uno dei primissimi risultati è stato innanzitutto che nonostante la bassa quantità di Vienna libero circolante di frazione tumorale. In periferia in realtà correlava molto bene con le i marcatori, diciamo quei parametri che descrivono la malattia nel midollo, come ad esempio la beta due microglobulina e la percentuale di plasmacellule. Quindi tante plasmacellule presenti nel midollo, tanto di Anna, Libro circolante in periferia. Ma il dato più interessante lo vedete illustrato in questo BRIC plot. Dove praticamente abbiamo messo a confronto per ciascun paziente il suo profilo di alterazioni genomiche derivanti dal clone midollare e, accanto, il profilo derivante dal sangue periferico. Come ho già descritto anche in letteratura c'è una grossa c'è una grande concordanza tra i due profili, quindi midollare e periferico, e questo da un lato rende il diario libero e circolante particolarmente attraente come marcatore, perché descrive quello che possiamo vedere nel midollo, quindi diciamo autorizza in qualche modo a usare un semplice prelievo di sangue periferico piuttosto che l'invasività del campione midollare. Noi siamo poi andati avanti perché ci siamo divertiti molto a caratterizzarlo. Perché in questo momento, nel diciamo nel mondo scientifico del mio lama multiplo di Anna libero circolante ancora non è così studiato come è studiato nei tumori solidi, il mio lama multiplo è ancora 1 1 ambito abbastanza libero. Come viene a libero? E quindi abbiamo caratterizzato, visto che ogni paziente ha una specifica frazione tumorale. Abbiamo messo in fila tutte queste frazioni tumorali e siamo andati ad individuare dal punto di vista statistico un cut off che permettesse di distinguere i pazienti che avevano un alto un'alta frazione tumorale da paziente a bassa frazione tumorale, dimostrando anche che questa il fatto di avere in nel sangue periferico un'alta frazione tumorale. Ovviamente è associata anche una prognosi sfavorevole. Quelli i pazienti che hanno un alto rilascio di frazione tumorale nel Vienna Libro circolante, quindi in periferia, sono pazienti che hanno anche alterazioni genomiche associate a prognosi sfavorevole. Ma il dato, diciamo quello che attira più attenzione di tutti, è che questi pazienti sono pazienti, come potete vedere illustrato da questo grafico, che hanno un alto numero di lesioni focali. Un'altro numero di lesioni parascheletriche lesioni extra midollari che sono lesioni che vanno al di fuori del midollo osseo, quindi che si riscontrano solo ed esclusivamente mediante esami di imaging e quindi, come vi accennavo precedentemente, il fatto di poterle riscontrare mediante biennale libero circolante rende questo tipo di marcatore molto utile. Abbiamo anche studiato quali potevano essere i meccanismi, dal punto di vista del Microambiente midollare, che potessero contribuire a un maggiore rilascio di Diana libero circolante, perché è vero che viene rilasciato mediante i meccanismi di morte cellulare. Ma noi sappiamo che il mieloma multiplo, che cresce, diciamo e prolifera nel midollo, in realtà le plasmacellule sono in qualche modo condizionate dal microambiente in cui vivono e proliferano e quindi siamo andati AA studiare una popolazione in particolare del microambiente, I cansara societed fibrolast, e abbiamo imputato a questa popolazione. Una tra le maggiori responsabili di un maggiore rilascio di viana libero circolante in periferia, questo perché quando sono presenti queste cellule abbiamo potuto notare anche un aumento di infiammazione dato da, per esempio aumento di marcatori come interloquini sei e tgf beta e così via. E quindi un maggiore Stato infiammatorio porta anche un maggiore rilascio di viana libero circolante. Ultima informazione puramente clinica, avendo dimostrato il valore prognostico del dianelibro circolante nel mioloma multiplo, siamo andati a vedere se poteva in qualche modo migliorare la stratificazione del rischio che si utilizza attualmente per, diciamo, profilare il rischio dei pazienti nel momento in cui gli viene fatta una diagnosi di mioloma multiplo. E abbiamo potuto notare, e qua lo vedete, plotato in queste curve di sopravvivenza. Che il il fatto di aggiungere questa caratteristica in più, lo studio di questa caratteristica in più degli anni libero circolante AI più coerentemente usati stratificatori del rischio permette di profilare meglio quei pazienti che verrebbero diciamo profilati come a rischio uno vengono profilati diciamo in maniera più precisa e quindi a rischio tre, quindi con una malattia più aggressiva del del previsto. Quindi in questa immagine abbiamo riassunto tutte queste informazioni che abbiamo dato finora, abbiamo appunto, tramite lo studio del genere libero circolante nel mio nome, abbiamo potuto vedere come i pazienti che hanno un'altra un'altra frazione tumorale nel sangue periferico solo pazienti che hanno una maggiore coinvolgimento anche nel midollo osseo della patologia. E hanno 1 1 maggiore malattia extra midollare che quindi permette di poter utilizzare questo marcatore poco invasivo per avere, diciamo, un riassunto di quello che succede nel midollo e in altre sedi. Sono pazienti nel quale in alcuni ambiente probabilmente sono stati infiammatorio più elevato rispetto ad altri e quindi diciamo questo è uno degli studi che porrà un po' le basi per un inserimento sempre più progressivo di questi marcatori periferici. Sia per profilare il rischio che per eventualmente studiare la malattia minima residua. Ultimissima parentesi, appunto sulla malattia minima residua, difficilissimo in questo momento ed è un po' la cosa che ci sta mettendo in difficoltà in laboratorio. Stiamo cercando in qualche modo di affrontare. Tutte i dati che vi abbiamo mostrato finora derivano dallo studio del del del dia libro circolante alla diagnosi di malattia, quindi quando c'è parecchia malattia nel midollo. Quando si ha la pretesa di studiare lo stesso identico marcatore nelle fasi post terapia, il lavoro è più difficile perché diminuendo la malattia a livello midollare diminuisce, cioè il paziente fortunatamente riceve la terapia, è in remissione l'ottanta percento delle volte e quindi si trova anche poca malattia nel periferico, quindi lo rende un marcatore un po' difficile da studiare. Abbiamo cominciato, come potete vedere da questo grafico, a profilare un po' le dinamiche. Di di come fluttua, diciamo il livello di della stazione tumorale degli anni Libri circanti in diversi pazienti. Ora diciamo stiamo cercando di appunto migliorarci da questo punto di vista e tutto questo è grazie a diverse persone che sono elencate in questa slide che sono i nostri colleghi prevalentemente che hanno reso possibile, diciamo, l'ottenimento di questi risultati. Il nostro direttore d'istituto che è il professore Michele cavo, la dottoressa Carolina Ferrania e la dottoressa Elena Zamagni che è Del gruppo clinico e tutte le persone che hanno diciamo reso possibile questo lavoro. Vi ringrazio anche a tutti per aver seguito questo webinar per per l'ascolto e siamo disponibili sia io che la dottoressa Taurisano per qualsiasi domanda al vostro servizio. Grazie 1000 Marina e Barbara per la interessante direi presentazione. Ringrazio di nuovo anche tutti gli utenti collegati sia per aver partecipato e anche per le numerose domande che sono arrivate durante il webinar. Ricordo ancora una volta che alla fine del webinar. Fra nelle prossime ore riceverete un'email con il link per accedere alla registrazione. Grazie di nuovo a tutti quanti e vi auguro una buona giornata. Grazie ancora. _1734123565556